استفاده از طیف سنجی جرمی برای مطالعات بیوشیمیایی بر روی حوزه های آنزیمی از پلی کتید سنتزها ۲۰۱۶
Using Mass Spectrometry for Biochemical Studies on Enzymatic Domains from Polyketide Synthases 2016

این پایان نامه گزارش مطالعاتی بر روی ویژگی بستر حوزه های کتوسینتاز (KS) حیاتی از پلی کتید سینتازهای (PKSs) ترانس-AT است. با استفاده از ترکیبی از طیف سنجی جرمی یونیزاسیون الکترواسپری (ESI-MS) و تقلیدکننده های سوبستر N-استیل سیستامین (SNAC) ساده، ویژگی طیفی از حوزه های KS از PKSهای باسیلائن و پسیمبرین با موفقیت از نظر مرحله آسیلاسیون اولیه کاتالیز KS مورد مطالعه قرار گرفته است.

به علاوه، توانایی تغییر تحمل بستر حوزه های KS از طریق جهش های نقطه ای ساده در محل فعال نشان داده شده است. مجموعه ای از آسیل-ACPها با استفاده از یک روش شناسی جدید سنتز شده و برای بررسی ویژگی بستر هم حوزه های KS و هم حوزه آسیل هیدرولاز PedC که قبلاً شناسایی نشده بود، به کار گرفته شده اند.

واکنش های طویل سازی زنجیره کاتالیز شده توسط KS نیز انجام شده و توسط ESI-MS/MS مورد پایش قرار گرفته اند. تمام حوزه های KS مورد مطالعه، ویژگی بستر بالاتری را در مرحله طویل سازی نسبت به مرحله آسیلاسیون قبلی نشان دادند. علاوه بر این، یک مکانیسم آسیلاسیون برگشت پذیر با استفاده از دو-حوزه ی PsyA ACP1-KS1 پیشنهاد می شود. یافته های این پایان نامه، بینش های مهمی را در مورد مکانیسم های ویژگی KS ارائه می دهند و نشان می دهند که می توان از جهش زایی برای گسترش مجموعه سوبسترهای قابل قبول برای مهندسی PKS آینده استفاده کرد.

This thesis reports studies on the substrate specificity of crucial ketosynthase (KS) domains from trans-AT Polyketide Synthases (PKSs). Using a combination of electrospray ionisation-mass spectrometry (ESI-MS) and simple N-acetyl cysteamine (SNAC) substrate mimics, the specificity of a range of KS domains from the bacillaene and psymberin PKSs have been succsessfully studied with regard to the initial acylation step of KS-catalysis.

In addition, the ability to alter the substrate tolerance of KS domains by simple point mutations in the active site has been demonstrated. A series of acyl-ACPs have been synthesised using a novel methodology and employed to probe the substrate specificity of both KS domains and the previously uncharcterised acyl hydrolase domain, PedC.

KS-catalysed chain elongation reactions have also been conducted and monitored by ESI-MS/MS. All KS domains studied exhibited higher substrate specificity at the elongation step than in the preceeding acylation step. Furthermore, a mechanism of reversible acylation is proposed using the PsyA ACP1-KS1 di-domain. The findings in this thesis provide important insights into mechanisms of KS specificity and show that mutagenesis can be used to expand the repertoire of acceptable substrates for future PKS engineering.